Sistemi essenziali per la cellula e bersagli degli agenti lesivi

Gli agenti lesivi per determinare un danno cellulare dovranno agire su sistemi cellulari che sono essenziali per la sopravvivenza ed il funzionamento della cellula. Una volta individuati questi sistemi sarà facile capire che questi stessi sistemi rappresentano il bersaglio principale dei diversi tipi di agenti lesivi.

Sistemi essenziali per la sopravvivenza di una cellula: 

• il mantenimento dell’integrità della membrana plasmatica. Questo sistema è rappresentato essenzialmente da tutte le proteine che fungono da pompe e che funzionano a livello della membrana plasmatica, garantendo omeostasi ionica e osmotica.
• la sintesi proteica (proteine sia di tipo strutturale che di tipo enzimatico). Per sopravvivere la cellula ha bisogno di attuare una adeguata sintesi proteica
• la produzione di energia, principalmente per la sintesi di ATP: i vari sistemi che consentono la respirazione aerobica
• la difesa del patrimonio genetico da qualsiasi tipo di danno 

I sistemi per la difesa del patrimonio genetico sono essenziali, infatti le nostre cellule sono dotate di vari sistemi deputati alla riparazione del DNA. È essenziale che tutti questi sistemi funzionino in modo corretto perché una cellula normale, se subisce un’alterazione a carico del suo patrimonio genetico, va incontro a due fenomeni:

• se è una cellula proliferante, allora essa va in blocco e smette di proliferare, in modo da consentire a questi sistemi enzimatici la riparazione del DNA;
• se i sistemi enzimatici non riescono a riparare correttamente il DNA, le cellule normali preferiscono mandare a morte per apoptosi la cellula stessa piuttosto che avere una cellula con un patrimonio genetico alterato che è potenzialmente una cellula tumorale.

Questi 4 sistemi sono essenziali per la sopravvivenza di una cellula, e sono anche i principali bersagli degli agenti lesivi.

Qualche agente lesivo ha dei bersagli cellulari molto specifici. È il caso del cianuro, un veleno che altera la respirazione mitocondriale andando a bloccare il funzionamento dell’enzima citocromo ossidasi localizzato a livello della catena respiratoria. 

Un altro esempio è il batterio ‘Clostridium perfringens’ che produce una molecola che va ad inibire un bersaglio specifico: la fosfolipasi, la quale degrada i fosfolipidi.

Per alcuni agenti lesivi non sono ancora stati individuati i bersagli specifici ma potenzialmente sappiamo essere inerenti ai quattro punti sopra elencati.

I cambiamenti biochimici coinvolti nel danno cellulare

indipendentemente dal tipo di agente lesivo, in una cellula che subisce un danno anche solo reversibile, si verificano i seguenti cambiamenti biochimici: 

• deplezione dell’ATP, ovvero una diminuzione, una mancanza della quantità di ATP prodotta e disponibile. La deplezione può essere dovuta ad un’alterazione a livello mitocondriale che può essere:

- una conseguenza diretta dell’agente lesivo (come il cianuro descritto in precedenza)

- una conseguenza indiretta, nel senso che l’agente in questione non ha direttamente alterato

mitocondri ma indirettamente ne ha diminuito la funzionalità e quindi la capacità di produrre

ATP.  Una diminuzione della produzione di ATP comporta sicuramente una alterazione di tutte

le funzioni ATP- dipendenti, come ad esempio la pompa sodio-potassio oppure la pompa del 

calcio, ma si può verificare anche una diminuzione della sintesi proteica perché, affinché le 

proteine vengano sintetizzate è  necessaria la presenza di ATP.

•       Alterazione dell’omeostasi intracellulare del calcio, poiché cambia la quantità di calcio all’interno della cellula e in particolare si ha un aumento dei livello del calcio. L’aumento di calcio può essere dovuto ad alterazioni del funzionamento della pompa del calcio, oppure è dovuto ad un aumentato rilascio dai depositi. Nella cellula il calcio si trova in forma libera nel citoplasma oppure si trova immagazzinato a livello di mitocondri e del reticolo endoplasmatico.

Se aumenta la quantità di calcio all’interno della cellula la conseguenza più grave è l’attivazione di tutti gli enzimi calcio-dipendenti, come le proteasi, le nucleasi e le lipasi calcio-dipendenti.. 

Se vi è l'attivazione di tutti questi enzimi, la cellula andrà incontro ad una maggior degradazione a livello dei substrati, dovuta principalmente all’azione delle proteasi e nucleasi. Quindi all’interno della cellula si osserverà un aumento dell’attività catabolica.

Inoltre, un aumento del calcio intracellulare può determinare un aumento della permeabilità della membrana mitocondriale e la conseguente induzione di morte per apoptosi. L’apoptosi può essere indotta con due vie: intrinseca ed estrinseca. In questo caso l’aumento del calcio intracellulare porta ad una alterazione della permeabilità della membrana che è l’evento iniziale della via intrinseca dell’apoptosi. La via intrinseca è quella che inizia con un’alterazione del rapporto tra proteine pro apoptotiche e anti apoptotiche.

•  Alterazione della permeabilità della membrana plasmatica. Il danno alla membrana plasmatica può essere:

- diretto, nel caso in cui si abbiano delle sostanze come tossine batteriche, agenti chimici o l’attivazione della risposta immunitaria (anticorpi), che hanno come conseguenza diretta un danno alla membrana plasmatica per attivazione del Sistema del Complemento

- indiretto, di solito dovuto alla formazione di ROS (specie reattive dell’ossigeno), che se prodotti in quantità eccessive danneggiano la cellula con tutta una serie di meccanismi. I radicali liberi danneggiano le membrane perché vanno ad alterare gli acidi grassi dei fosfolipidi di membrana. Inoltre, quando i radicali liberi interagiscono con gli acidi grassi dei fosfolipidi di membrana determinano la perossidazione di questi acidi grassi e i prodotti della perossidazione sono a loro volta tossici, hanno funzione detergente e quindi una amplificazione del danno.Un danno indiretto può derivare anche per l’attivazione degli enzimi calcio-dipendenti come lipasi e proteasi.

Se si verifica una diminuzione del metabolismo della cellula si avrà anche una diminuzione della sintesi dei fosfolipidi e quindi un’alterazione della struttura della membrana stessa.

Danno e morte cellulare: danno da Radicali liberi

Occorre soffermarsi sugli aspetti caratteristici della specie molecolare dei radicali liberi,  soprattutto i meccanismi attraverso i quali i radicali liberi in generale, inducono danno nella cellula. In particolare sugli aspetti patologici di queste molecole, rispetto agli aspetti fisici e biochimici.

I radicali liberi sono delle specie chimiche caratterizzate da un elettrone spaiato nell’orbitale più esterno, questo assetto elettronico li rende in generale delle specie altamente reattive perché cercano di stabilizzarsi. Questa ricerca della stabilità rende la molecola stessa altamente reattiva, un radicale libero cerca di stabilizzarsi sottraendo un elettrone ad un’altra molecola. Inizia una reazione a catena, il radicale libero si stabilizza a discapito di un'altra molecola che perde un elettrone e diventa reattiva.

I radicali liberi più noti sono i radicali liberi dell’ossigeno, però in realtà possono esserci radicali dell’azoto (RNS). Concentriamo l’attenzione su quelle che sono le specie reattive dell’ossigeno, cioè i cosiddetti ROS. Esistono diverse specie di ROS: quelle che sono più abbondanti per la produzione e quelle che sono più reattive nei confronti delle altre molecole biologiche.  

• Anione superossido
• Radicale idrossilico
• Radicale idroperossilico (si forma abbastanza frequentemente ed è anche altamente reattivo)
• Ione perossido. E' uno dei “componenti” del perossido di idrogeno. Anche se è uno ione, rientra nella categoria dei ROS perché ha un comportamento e una reattività, nei confronti delle altre molecole biologiche, molto simile a quello dei radicali, per cui viene assimilato ad essi anche se dal punto di vista puramente chimico non lo è.

I radicali liberi, si formano nel nostro organismo ma il grosso del problema è rappresentato dal fatto che in caso di danno la quantità di ROS aumenta. Ora vediamo quali sono le fonti che producono normalmente i radicali liberi:

• Fonti esogene. I radicali liberi si possono formare all’interno del nostro organismo, ogni qual volta si verifica un fenomeno di assorbimento di energia radiante. Oppure si formano radicali liberi a partire da alcune sostanze cancerogene presenti nel tabacco (esposizione a fumo di sigaretta). Infine, si formano radicali a causa di inquinanti ambientali. Possono essere delle fonti esogene di produzione di radicali, tutti quei cibi che noi assumiamo e che contengono ferro e rame.
• Fonti endogene: produzione di radicali liberi dovuta a processi metabolici normali all’interno delle cellule del nostro organismo. In una catena di trasporto di elettroni, si formano sempre radicali liberi. Tra le fonti endogene che portano alla produzione di radicali liberi, c’è il normale metabolismo enzimatico degli xenobiotici (xeno = estraneo ----> xenobiotici. Sono molecole/composti esogeni estranei all’organismo), soprattutto a livello degli epatociti. Il sistema di metabolizzazione delle sostanze esogene, localizzato a livello del reticolo endoplasmatico liscio: il sistema del citocromo p450 detto anche “drug metabolism system”. Il sistema del citocromo p450 è una catena di trasporto di elettroni; il passaggio della sostanza esogena lungo questa catena di trasporto di elettroni, può detossificare oppure attivare questa catena che trasforma la sostanza, ma porta anche alla produzione di radicali liberi.

Perché si producono radicali liberi? Perché è presente una catena di trasporto di elettroni e in realtà i radicali liberi sono delle specie molecolari che, sulla base del loro assetto di elettroni, sono instabili e quindi “a caccia di elettroni”. Quindi ogni qual volta vi è una catena di trasporto di elettroni, vi è anche la possibilità che si formino dei radicali liberi.

I radicali liberi si formano fisiologicamente nelle nostre cellule grazie all’attività dei perossisomi. A livello dei perossisomi avvengono tanti metabolismi tra cui la β-ossidazione degli acidi grassi, una reazione di ossidoriduzione, cioè una reazione in cui si verifica uno scambio di elettroni. I radicali liberi si formano “volontariamente” anche durante il processo infiammatorio.

 Ruolo dei radicali liberi prodotti in maniera fisiologica

La cellula produce normalmente, soprattutto attraverso i metabolismi, specie radicaliche dell’ossigeno. I radicali liberi dell’ossigeno, quando sono prodotti in quantità “fisiologiche”, non solo non danneggiano le cellule, ma possono anche svolgere una funzione di secondi messaggeri (una molecola si forma a seguito di una reazione e dà origine ad un effetto biologico), quindi svolgono comunque un ruolo nella regolazione di numerose vie di trasduzione del segnale. Attraverso il ruolo svolto sulle vie di trasduzione del segnale, i radicali liberi sempre prodotti in quantità fisiologica, possono anche arrivare a regolare l’espressione di alcuni geni. E poi possono dare origine a delle modificazioni reversibili delle proteine (es. fosforilazione/defosforilazione).

Se la cellula produce radicali liberi in quantità fisiologiche ed in un ambiente controllato, come nei fago-lisosomi, può usare quest’arma per danneggiare le componenti molecolari di un agente che deve eliminare. Quindi sicuramente prodotti in eccesso danneggiano la cellula ed i tessuti, ma ci sono situazioni in cui la cellula li produce in modo quasi fisiologico.

Molecole ed enzimi Scavenger dei radicali liberi

Se le cellule producono radicali liberi in quantità superiori a quelle fisiologiche, è necessario che le stesse cellule posseggano dei meccanismi di difesa: devono fare in modo di non subire dei danni conseguenti all’aumentata produzione di radicali liberi. Ciò vuol dire che sia le nostre cellule che l’organismo in toto, possiedono delle molecole e dei sistemi enzimatici che hanno la funzione di bloccare l’azione dei radicali liberi: questi sistemi prendono il nome di scavenger dei radicali liberi (scavenger = spazzino).

 Ecco come funzionano queste molecole e sistemi antiossidanti, partendo dalle molecole:

Cisteina: La cisteina è la più semplice di queste molecole, ha proprietà antiossidanti perché contiene il gruppo sulfidrilico -SH. 

Glutatione: da un punto di vista biochimico, è definito un falso tripeptide, perché nonostante sia costituito da tre amminoacidi (cisteina, glicina e acido glutammico), è presente un legame peptidico canonico e un legame peptidico anomalo. Il glutatione deve le sue proprietà antiossidanti, anche in questo caso al gruppo SH della cisteina che contiene. Da un punto di vista quantitativo, il glutatione è l’antiossidante più abbondante presente all’interno delle nostre cellule e logicamente se ha una funzione antiossidante, vuol dire che può essere presente sia in forma ridotta (GSH) che in forma ossidata (GSSG). GSH significa è presente il gruppo -SH della cisteina, in grado di cedere un elettrone. GSSG significa che il glutatione è ossidato perché si è perso il gruppo -SH e si è formato un legame ponte disolfuro (SS) tra due molecole di glutatione che hanno ceduto due elettroni a due radicali liberi stabilizzandoli. Il passaggio dalla forma ridotta a quella ossidata rappresenta il ciclo del glutatione. Cruciale per l’attività antiossidante del glutatione è l’enzima glutatione reduttasi, la quale utilizza dei NADPH che svolgono una funzione di coenzimi per riportare il GSSG a GSH in modo che possa funzionare da antiossidante. La glutatione reduttasi ha come coenzima il NADPH. Il cofattore generalmente è inorganico e non partecipa alla reazione, il coenzima sì.

Vitamina C: utilizzata per il mantenimento delle difese antiossidanti della cellula, è uno scavenger dei radicali liberi. Svolge anche la funzione importante di contribuire alla rigenerazione della vitamina E. Anche la vitamina C cicla tra una forma ossidata (Acido L-deidroascorbico) e una forma ridotta (Acido L-ascorbico). Inoltre, la vitamina C è importante per l’assorbimento ed il metabolismo del ferro.

Vitamina E: chiamata anche α-tocoferolo. Il termine α-tocoferolo non fa riferimento ad un'unica sostanza, ma a otto isomeri diversi, i quali però svolgono la stessa funzione. La vitamina E è il più importante antiossidante liposolubile.

Sistemi enzimatici Scavenger dei radicali liberi

Glutatione perossidasi: è un enzima appartenente alla classe delle ossidoreduttasi, che catalizza la seguente reazione:

2 glutatione + H₂O₂ ⇄ glutatione disolfuro + 2 H₂O

Superossido dismutasi SOD: catalizza la reazione di trasformazione del radicale anione superossido in acqua ossigenata. Esistono 3 diverse isoforme di SOD, con una localizzazione diversa: a livello mitocondriale, extracellulare e citoplasmatica.

Catalasi: catalizza la degradazione dell’acqua ossigenata, che viene formata a seguito dell’azione della superossido dismutasi. La catalasi è localizzata nei perossisomi.

Anche altre molecole svolgono una funzione antiossidante o comunque sono coinvolte nella regolazione dell’equilibrio redox nelle cellule del nostro organismo: alcune di queste molecole sono prodotte dal nostro organismo, altre le possiamo assumere dall’esterno, di natura esogena.

Transferrina e ferritina sono coinvolte nel metabolismo del ferro, la ceruloplasmina è coinvolta nel metabolismo del rame. Queste molecole sono responsabili della mobilizzazione o comunque dell’accumulo di elementi come Fe e Cu, quindi queste molecole funzionano anche come accettori e donatori di elettroni.

Retinolo o vitamina A e la funzione del coenzima Q10 localizzato all’interno dei mitocondri, nel sistema di trasporto degli elettroni  si ricollegano alla funzione antiossidante legata al trasporto di elettroni nella catena mitocondriale.

Queste sostanze vengono prodotte dal nostro organismo, però ci sono delle altre sostanze antiossidanti che è possibile assumere attraverso gli alimenti (frutta e verdura).

Tra le molecole con funzione antiossidante: i polifenoli, i flavonoidi, le  catechine, i terpeni, l’acido lipoico, il resveratrolo (un fenolo prodotto e  contenuto negli acini d’uva rossa, viene trasferito nel vino rosso); il licopene, molecola che è abbondante nel pomodoro e consigliata  soprattutto ai soggetti maschi per evitare problemi di prostata.  Queste sono tutte molecole che si trovano negli alimenti naturali e che combattono i radicali liberi in eccesso.

Danni causati dai radicali liberi

I radicali liberi prodotti in eccesso danneggiano la cellula perché si procurano l’elettrone che serve loro per stabilizzarsi, andando a sottrarlo a quelle che sono le principali biomolecole cellulari: lipidi, proteine e acidi nucleici.

Danno a carico dei lipidi per interazione con i radicali liberi

Il bersaglio principale dell’azione dei radicali liberi è rappresentato dai cosiddetti acidi grassi polinsaturi o PUFA (acronimo inglese di PolyUnsaturated Fatty Acids) che vanno a costituire le code dei fosfolipidi di membrana. I radicali vanno a procurarsi l’elettrone che serve loro per stabilizzarsi, andando a sottrarlo a livello del doppio legame degli acidi grassi polinsaturi. La perossidazione lipidica è il fenomeno di danno agli acidi grassi polinsaturi, dovuto all’interazione con i radicali liberi.

Il bersaglio sono i PUFA. E' noto che gli acidi grassi nella cellula sono essenzialmente i componenti dei fosfolipidi che costituiscono le membrane:ultima analisi, l’interazione dei radicali liberi con i PUFA delle membrane, danneggerà tutte le membrane cellulari.

Supponiamo che PUFA, abbia tre doppi legami, R è il radicale libero, il quale si stabilizza sottraendo un elettrone all’acido grasso polinsaturo e diventando un RH. La conseguenza è che questo PUFA diventa a sua volta un radicale, quindi si avrà un radicale di un acido grasso. La prima cosa che un radicale libero di un acido grasso può fare in una membrana è stabilizzarsi ad opera di un altro acido grasso: si verifica quindi una reazione a catena, in cui un acido grasso si stabilizza a discapito di un altro. In presenza di ossigeno e successivamente di ferro (devono essere presenti entrambi, perché la prima fase è scatenata dalla presenza di ossigeno e poi le fasi successive dalla presenza di ferro) il radicale dell’acido grasso può andare incontro anche ad un altro destino: un break down, cioè una rottura di tipo ossidativo, una progressiva degradazione di tipo ossidativo. Il radicale dell’acido grasso polinsaturo si rompe progressivamente, fino ad arrivare a livello dei prodotti della perossidazione lipidica, che sono sempre delle molecole di tipo carbonilico ma molto più piccole. Questi prodotti della perossidazione lipidica e in particolare le aldeidi, sono a loro volta tossici.

Quindi, partendo dal PUFA, che diventa radicale lipidico quando viene sottratto un elettrone, ci sono le reazioni intermedie o perossidazione lipidica e per ultimo il fenomeno della frammentazione, si arriva a prodotti carbonilici: aldeide ed etano. In definitiva: perdita di struttura, perdita la funzionalità, addirittura si ottengono prodotti di degradazione che sono tossici. Questo per quanto riguarda il danno a carico dei lipidi, dovuto ai radicali liberi.  Causa di questo fenomeno: nell’ambito di quella che è la struttura di una membrana, i fosfolipidi svolgono sia una funzione strutturale, e proprio per la presenza degli acidi grassi polinsaturi, svolgono anche un ruolo di modulatori della fluidità di membrana. Partendo da una plasma-membrana che ha tutti gli acidi grassi polinsaturi al posto giusto e ha una certa fluidità, alla fine si arriva ad una condizione in cui l’acido grasso polinsaturo non c’è più, quindi si perde la funzione strutturale, ma si perde anche la funzione che garantisce la fluidità di membrana.

La perossidazione lipidica scatenata dai radicali liberi a carico dei PUFA dei fosfolipidi di membrana, determina in ultima analisi, un’alterazione strutturale (non c'è più l’acido grasso) e una conseguente alterazione funzionale. 

I ROS o in generale i radicali liberi, interagendo con i fosfolipidi di membrana, determinano un danno strutturale e funzionale della membrana stessa, quindi il danno causato dai radicali liberi a carico dei lipidi è dovuto alla perossidazione lipidica.

Danno alle proteine per interazione con i radicali liberi

I radicali liberi possono stabilizzarsi anche a discapito delle proteine: il bersaglio dell’interazione dei radicali liberi in una proteina è il gruppo sulfidrilico dell’amminoacido cisteina, presente nelle proteine. I radicali andranno a sottrarre lì un elettrone per stabilizzarsi. E' lo stesso principio della funzione antiossidante della cisteina e del glutatione, ma in questo caso è in senso offensivo, mentre precedentemente era in senso difensivo. 

I radicali liberi a carico delle proteine, si stabilizzano andando a sottrarre un elettrone sempre a livello dei gruppi -SH. Nelle proteine, la presenza di gruppi -SH è importante, perché di solito gli amminoacidi che hanno un gruppo -SH, sono localizzati nel centro funzionale della proteina stessa. Allora se si sottrae un elettrone al gruppo -SH di una proteina, la funzionalità viene alterata.

Danno a carico del DNA per interazione con radicali liberi

I radicali liberi danneggiano il DNA, determinando la rottura dei filamenti, legami crociati e mutazioni di basi. Quando si hanno questi danni, si parla di un danno di tipo ossidativo ed esiste un marcatore di danno ossidativo di radicali liberi a carico del DNA: 8 idrossi-deossiguanosina (8-OHDG). Se si espongono cellule ad una fonte di radicali liberi, si può verificare l’eventuale danno al DNA dosando questo marcatore di danno ossidativo.

I radicali liberi prodotti in eccesso creano un danno a proteine, lipidi e DNA; per quanto riguarda il danno cellulare, le ripercussioni più immediate, sono quelle dovute ai fosfolipidi di membrana, e il danno alle proteine. In questo contesto la cellula muore prima perché ha la membrana alterata, non perché ha il DNA alterato. Il danno al DNA si renderà evidente quando si deve trascrivere e tradurre il gene alterato, se il danno fosse a carico di una porzione di DNA che non viene trascritta e tradotta, quel danno non si manifesterebbe. 

 Alterazioni morfologiche della cellula in caso di danno

Cambiamenti biochimici accompagnano il danno cellulare, ora vediamo quali sono le alterazioni morfologiche. Occorre distinguere, quelle che sono le alterazioni morfologiche tipiche di un danno reversibile e quelle tipiche di un danno irreversibile (danno in cui si ha il superamento del punto di non ritorno).

Alterazioni morfologiche nel danno reversibile

• Rigonfiamento cellulare: La prima alterazione morfologica visibile in una cellula che subisce un danno reversibile, è il rigonfiamento cellulare in quanto si verifica un’alterazione dell’equilibrio elettrolitico, dovuto alla diminuzione di ATP, che determina un’alterazione del funzionamento delle pompe (per esempio Sodio/Potassio). Aumentano gli elettroliti, i soluti, all’interno della cellula. Se aumentano i soluti all’interno della cellula, è come se questa cellula fosse più concentrata e cerca di ovviare questa situazione introducendo acqua dall’esterno, per cui introducendo acqua dall’esterno, la cellula si rigonfia.  Questo accumulo di acqua all’interno della cellula determinerà anche un rigonfiamento degli organuli circondati da membrana: avremo quindi all’interno della cellula, mitocondri rigonfi (ma senza altre alterazioni morfologiche), le creste mitocondriali saranno intatte in quanto danno reversibile. In condizione di danno reversibile, i mitocondri sono più gonfi, però non subiscono un’alterazione a livello delle creste, perché se subissero un’alterazione a livello delle creste, il danno diventerebbe irreversibile. Avremo anche un reticolo endoplasmatico sia liscio che rugoso, rigonfio. Analizziamo quello rugoso: se è prresente un reticolo endoplasmatico rugoso rigonfio, si possono staccare dei ribosomi. Nel reticolo endoplasmatico rugoso se c’è il distacco di qualche ribosoma, la conseguenza sarà una riduzione della sintesi proteica, senza rottura.  
• Addensamento della cromatina. Un altro cambiamento morfologico già presente nel danno reversibile è l’addensamento della cromatina. La cromatina non sarà distribuita in modo più o meno uniforme all’interno di tutto il nucleo ma sarà condensata, più scura da un punto di vista istologico perché concentrata in alcune zone.
•  Accumuli di Lipidi: a seconda del tipo cellulare, accumuli di lipidi nel citoplasma.
• Vacuoli: all’interno del citoplasma ci sono generalmente dei vacuoli.
• Blebs: In alcuni casi si può osservare la formazione di blebs sulla plasma-membrana. I blebs sono estroflessioni della membrana cellulare. Si verificano quando c'è un distaccamento della plasma membrana dal citoscheletro sottostante.  Nela formazione di blebs nel danno reversibile, la membrana cellulare è ancora integra.